长生不老是很多人的梦想，目前一项极具发展潜力的生物医药技术——基因疗法似乎为我们提供了一条可能的路径：借助基因战胜基因，让“逆天改命”成为希望。圣方医药研发推出【insight 基因疗法】系列文章，系统性地向大家分享基因疗法的前沿进展、应用等，以期让更多的人认识及了解基因治疗。欢迎各位同业积极与我们交流，携手促进行业发展。
基因治疗的关键步骤是如何有效地通过递送载体将基因传递到目标组织、细胞，根据载体的属性分为：病毒类递送载体和非病毒类递送载体。本期文章我们分享基因疗法的病毒载体和非病毒载体递送系统。
病 毒 载 体
在病毒类递送载体中，以逆转录病毒、腺病毒（Ads）和腺相关病毒（AAVs）的使用最为广泛，主要应用于新型疫苗和癌症治疗。
逆转录病毒
逆转录病毒是第一个在体内基因治疗的临床试验中被研究的病毒载体。逆转录病毒是一种有包膜的球形病毒，以RNA的形式携带其遗传物质。逆转录病毒载体可以将其遗传物质（单链RNA）反向转录成双链DNA，并整合到宿主细胞的基因组中。
用于基因治疗的逆转录病毒载体的主要优点是它们可以携带一个大的目的基因（9-12kb），并由它们整合到宿主基因组中而导致基因的长期表达。然而，几个主要缺点限制了它们的应用。首先，逆转录病毒载体需要细胞分裂才能将其DNA整合到宿主基因组中，因此它们只能转导分裂中的细胞。此外，逆转录病毒载体有将其DNA随机插入宿主染色体并导致插入突变的风险。为了降低插入突变的风险，已开发出具有长末端重复序列启动子或增强子缺失的自失活载体。由于这些局限性，逆转录病毒载体目前不再经常用于临床研究。
腺相关病毒（AAV）
AAV是一种小的、无包膜的细小病毒，AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。目前，有数百种腺病毒亚型被发现，被分为A-G七个亚型。
科学家会对腺相关病毒进行编辑，使之携带治疗用基因片段，并使用合适的启动子控制这些基因在正确的靶标组织中表达，许多使用这套治疗方法的药物仅一次注射就可以确保长期有效。总的来说采用重组腺相关病毒的基因药物十分精准高效。
大多数成功的用于临床前和临床研究的AAV仅限于天然的衣壳血清型，但这些AAV血清型在临床上的广泛应用存在明显的局限性，另一个问题是基因组（4.7kbp）的大小限制。AAV可以通过衣壳修饰、表面偶联和封装进行设计，以解决天然AAV的局限性。
AAV载体
AAV载体是公认的基因治疗通用载体，各种血清型趋向性广泛，开发用于中枢神经系统、眼睛、肝脏、心脏和肌肉疾病。AAV载体基因组通过ITR重组头尾相连进行环化，形成稳定和持久的游离结构，能长期存在于未分裂、最终分化的细胞群中而不被细胞当做外源DNA降解。
与现有的其他病毒载体相比，AAV免疫原性最低，几乎没有毒性，无致病性。然而，AAV载体研究发现其利用体外模型评估性能并不理想，临床试验前需进行更多动物模型的研究，作为基因治疗药物的另一局限性在于工艺上无法实现无杂质载体的生产。现有的生产方案，普遍策略是实现包装AAV所需的必需因子的最优反式表达，提高载体产量，
目前，以病毒作为载体的基因疗法的临床试验已经超过了1000项，充分展现了病毒载体在基因治疗中的广阔前景。
非 病 毒 载 体
虽然病毒载体具有高转染效率的优势，是基因疗法中常用的载体，但由于其装载能力有限、免疫原性以及诱发突变等风险，它们的应用受到严重的限制。此外，由于病毒携带的基因会在细胞中长期表达，可能产生较严重的毒副作用。而非病毒载体因其免疫原性低、安全性高、稳定性高和易于化学修饰等优点受到了越来越多的关注和重视，而且非病毒载体也易于大规模制备，同时不受递送的基因序列大小的限制。
非病毒载体通常用于转移化学合成的小DNA（寡核苷酸）或相关分子、大DNA分子（质粒DNA）、RNA （Ribozymes、SiRNA、mRNA）类型的核酸。基于此，大量的非病毒基因递送载体，如聚合物材料、无机纳米材料、细胞穿膜肽、阳离子脂质、N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）等被开发用于基因治疗。
其中，脂质纳米粒（LNP）和GalNAc这2种递送系统已在临床中实现了大规模的应用。早在2018年，FDA就批准了第一款siRNA药物patisiran，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR），该产品使用的就是LNP递送系统。
然而非病毒载体也存在一些缺陷，相比于病毒载体，非病毒载体的转染效率较低，基因转染机制尚不明确，且宿主细胞的反应机制仍需深入研究。为了克服这些挑战并提升非病毒载体的稳定性和效力，有必要进行更深入的探索和研究，包括提高转染效率、优化载体在宿主细胞核中的构建和维持，以及降低质粒损失、细胞毒性和生产成本等方面的措施。
根据近几年临床试验以及各大龙头企业的投资和布局趋势，非病毒载体药物的潜力和价值正在逐步体现。
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4. Srivastava A. AAV Vectors: Are They Safe? Hum Gene Ther. 2020 Jul;31(13-14):697-699. doi: 10.1089/hum.2020.187. PMID: 32611206.
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